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國立中興大學 動物科學系所 林亮全所指導 翁瑋琤的 探討以豬眼球萃取玻尿酸萃取物並以體外模式評估改善退化性關節炎之研究 （2014），提出Kobo $555 PTT關鍵因素是什麼，來自於豬眼球玻璃體、玻尿酸、退化性關節炎、抗氧化。

而第二篇論文長庚大學 生物醫學研究所 王鴻利所指導 陳筑毓的 藉由基因轉殖鼠模式探討突變(G2019S)LRRK2 引起帕金森氏症的致病機轉 （2012），提出因為有 帕金森氏症、多巴胺神經元、轉殖鼠、液相層析質譜、穿透式電子顯微鏡的重點而找出了 Kobo $555 PTT的解答。

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探討以豬眼球萃取玻尿酸萃取物並以體外模式評估改善退化性關節炎之研究

為了解決Kobo $555 PTT的問題，作者翁瑋琤 這樣論述：

本研究以廢棄豬眼球作為原料，分為現場採樣及冷凍解凍處理組，現場採樣處理組於豬隻屠宰後立即取出眼球內玻璃體並萃取其玻尿酸，分別以A、B及C三種純化方法進行萃取純化，經冷凍乾燥後成玻尿酸萃取物(hyaluronic acid, HA)粉末，進行成分分析。冷凍解凍處理組將眼球摘下後急速冷凍，分別以室溫解凍(room temperature, RT)、冷藏解凍 (refrigeration, 4℃)及遠紅外線解凍(far infrared, FIR)三種方法進行解凍，再以現場採樣處理組中最佳萃取方法進行冷凍解凍處理組HA之萃取純化並分析其成分；根據成分分析結果選出豬眼球玻璃體HA最佳萃取方法之成品進

行抗氧化能力分析及細胞試驗，細胞試驗中成品與人類軟骨肉瘤細胞(SW1353)共培養，探討其對於促進細胞增生、Interleukin-1β (IL-1β)誘導下細胞存活率、蛋白聚醣(Proteoglycan, PG)分泌情形及退化性關節炎相關細胞因子基因表現量之影響，藉此以體外模式初步評估HA延緩退化性關節炎病程之能力。結果顯示：每顆豬眼球中約有3.63克之玻璃體及0.48克之水晶體。現場採樣處理組玻璃體呈透明無色、黏稠狀，水晶體呈完整之橢圓形，而冷凍解凍處理組之水晶體被分解難與玻璃體做分離，且玻璃體混濁為黑色液體狀，與血液混合。現場採樣處理組每100克玻璃體用A、B及C三種萃取法，分別可萃取出

2.3588 mg、1.2027 mg及2.1728 mg之純HA，其分子量800 kDa以上分別有20.797%、9.093%及45.430%，而冷凍解凍處理組用RT、4℃及FIR三種方法解凍再以C法萃取HA，分別可萃取出0.8957 mg、0.9262 mg及1.1589 mg之純HA，但HA被分解，分子量皆小於50 kDa。因此選擇現場採樣C處理組之冷凍乾燥成品進行後續試驗，HA成品製備成濃度為0.1、0.3、0.5、1.0及10 mg/mL之溶液，另有僅添加IL-1β誘發發炎之negative control (NC)組，無添加IL-1β及HA之blank組當作對照。體外抗氧化能力試驗

中，豬玻璃體HA具有良好之螯合亞鐵離子能力，濃度高之處理組效果最佳，其於10 mg/mL之螯合率可達53.99%；DPPH自由基清除能力及還原力之抗氧化效果較差，且不同濃度之HA間無顯著差異；超氧陰離子清除能力方面，隨著HA濃度下降，超氧陰離子清除能力越低。HA於細胞增生試驗中，共培養1天後，各濃度處理組細胞增生量低於blank組，培養第3天各濃度處理組細胞增生量顯有高於blank組的趨勢，第5天後各濃度處理組細胞增生量皆低於blank組(p < 0.05)。在IL-1β誘發發炎下細胞增生率試驗中共培養5天後，與blank組相比NC組有下降之趨勢，而各濃度處理組中以HA 1.0 mg/mL組之

細胞增生量顯著高於NC組(p < 0.05)，且隨濃度降低，增生量逐漸降低。在IL-1β誘發發炎下HA對SW1353蛋白聚醣分泌量之影響，NC組之蛋白聚醣分泌量顯著低於blank組，而各濃度HA處理組之蛋白聚醣分泌量顯著高於NC組(p < 0.05)，且隨著濃度增加，蛋白聚醣分泌量增加。HA在IL-1β誘發發炎下SW1353中促發炎細胞因子基因表現量之結果方面，MMP-3、MMP-13、TNF-α及IL-8之表現量，NC組顯著高於blank組，而各濃度HA處理組濃度高者抑制能力越佳，HA 1.0組顯著低於NC組(p < 0.05)；而iNOS之表現量NC組低於blank組，但無顯著差異，HA處

理組iNOS表現量有較低之趨勢，但無顯著差異。綜觀上述，本試驗從豬眼球萃取玻尿酸最佳的方法為現場採樣C處理組，其可萃取較多之玻尿酸，且分子量大於800kDa之比例較多；於體外試驗中能有減緩退化性關節炎病程，未來可進一步於體內試驗中探討其對於退化性關節炎之影響，以提升豬隻屠宰副產物之附加價值，增加業界收益並減少屠宰廢棄物之汙染。

藉由基因轉殖鼠模式探討突變(G2019S)LRRK2 引起帕金森氏症的致病機轉

為了解決Kobo $555 PTT的問題，作者陳筑毓 這樣論述：

第八型顯性遺傳性帕金森氏症(PARK8)病患呈現顯性遺傳及晚發性的帕金森氏症臨床症狀，近期研究顯示leucine-rich repeat kinase 2 (LRRK2)基因突變為導致八型遺傳性帕金森氏症的原因。LRRK2的基因突變為最常見引起晚發性顯性遺傳帕金森氏症的病因，除此之外LRRK2基因突變亦可以在偶發性的帕金森氏症患者中發現，而在第八型顯性遺傳性帕金森氏症的基因突變中，G2019S是最普遍的胺基酸突變。病患因LRRK2基因突變引起的帕金森氏症與偶發性的病患具有相似的晚發性臨床表徵，顯示了此二者帕金森氏症的致病過程很可能源自於相同分子病理機轉。因此藉由了解突變LRRK2引起帕金森氏

症候群的細胞及分子機轉可以進一步了解第八型顯性遺傳性帕金森氏症以及偶發性帕金森氏症的致病機轉。在本研究中，雜交CMV增強子/PDGF-β啟動子調控的轉殖基因在黑質多巴胺神經元中有高表現量，因此用於製備基因轉殖鼠表現野生型或突變型（G2019S）LRRK2。與帶有（G2019S）LRRK2突變的帕金森氏症患者相似，帶有（G2019S）LRRK2基因的轉殖鼠在12-16個月時表現出黑質多巴胺神經元死亡和帕金森表型的運動功能障礙。然而表現野生型LRRK2的基因轉殖鼠並沒有顯示黑質多巴胺神經元死亡和運動功能障礙。 LRRK2 是mixed lineage kinase（MLK）亞族MAPKKKs的成員

，G2019S突變被認為會增加功能和活化LRRK2的激酶活性。過度表現突變（G2019S）LRRK2於HEK 293細胞中增加了MAPK kinase 4（MKK4）在Ser257磷酸化，並且在基因轉殖鼠的黑質也發現了MAPK kinase 4（MKK4）在Ser257磷酸化增加。在（G2019S）LRRK2轉殖鼠的黑質部位發現 MKK4Ser257 的下游目標蛋白即活化的phospho-JNKThr183/Tyr185和 phosphor-c-JunSer63蛋白質水平表現量皆顯著增加。並且在（G2019S）LRRK2轉殖鼠的黑質部位發現phosphor-c-JunSer63 的目標基因，亦

即為促細胞凋亡的基因Bim和FasL mRNA表現量，以及活化的caspase-9，caspase-8和caspase-3的表現也都有上升的趨勢。為進一步了解突變 (G2019S) LRRK2 引起的黑質紋狀體系統神經退化以及導致的帕金森表型致病機轉，藉由蛋白質體學分析鑑定在大腦皮質或黑質神經中可能被突變 (G2019S) LRRK2磷酸化的蛋白質受質是必須的。我們使用液相層析質譜的蛋白質分析顯示突變 (G2019S) LRRK2在大腦皮質或是黑質可能的磷酸化受質參與調控了突觸的形成與運輸、調控各種訊息傳遞、粒線體功能、興奮性神經物質傳遞以及神經元的存活與分化。帕金森氏症的致病機轉中，粒線體的

形態及功能異常和上升的氧化壓力扮演著重要的角色，並且LRRK2 已被發現會表現在粒線體外膜上。在本研究中使用穿透式電子顯微鏡發現不同型態的粒線體存在於野生型及突變型(G2019S) LRRK2基因轉殖鼠的黑質緻密部之多巴胺神經元中。在突變型(G2019S) LRRK2基因轉殖鼠的黑質緻密部之多巴胺神經元中發現粒線體腫脹、內嵴斷裂以及空泡狀退化，而統計學分析顯示了在突變型 (G2019S) LRRK2基因轉殖鼠中粒線體的長寬比值有顯著下降，顯示了突變型 (G2019S) LRRK2會引起粒線體斷裂。本研究應可使我們瞭解第八型顯性遺傳性帕金森氏症與偶發性帕金森氏症的致病機轉，並用於發展可能的帕金森

氏症治療方法。

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